- 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國(guó)疾控中心譚文杰教授提供。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用SPF級(jí)2-4歲雄性恒河猴，2.5-3.5kg，來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所（IACUC 批準(zhǔn)號(hào)：BLL20001）
- 實(shí)驗(yàn)環(huán)境
所有涉及的病毒實(shí)驗(yàn)操作全部在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所ABSL-3實(shí)驗(yàn)室完成，該實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和福利倫理資質(zhì)。
- 病原培養(yǎng)鑒定
將新型冠狀病毒接種到Vero細(xì)胞進(jìn)行分離和儲(chǔ)存。Vero細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM（英濰捷基, 美國(guó)）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，環(huán)境為37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標(biāo)準(zhǔn)的半數(shù)細(xì)胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）進(jìn)行分析。
- 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程
（1） 感染途徑：經(jīng)氣管感染；
（2） 感染劑量：1×106 TCID50 只；
（3） 感染體積：1ml/只；
（4） 對(duì)照組：等體積 PBS。
4.3 動(dòng)物模型分析
（1）癥狀觀察：感染后，每天觀察動(dòng)物一般癥狀，記錄體重和體溫等。
（2）病毒載量：定時(shí)收集各組動(dòng)物臟器，進(jìn)行RNA抽提，利用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)組織中病毒載量。RT-PCR所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。
（3）病毒分離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細(xì)胞分離病毒并觀察細(xì)胞病變。
（4）影像學(xué)檢查：感染后 0,3,5,7,9,11,13,15天做X-RAY檢測(cè)。
（5）病理學(xué)觀察 用新鮮的組織福爾馬林固定，制備石蠟切片，用HE，免疫組化或熒光染色，鏡下觀察。
（6）免疫學(xué)檢測(cè)：感染后第3，4，6，7，11，14天全血進(jìn)行白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞檢查和CD3+,CD4+,CD8+,巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，以及血清中特異性抗體。
4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法
所有的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，感染組小鼠和其他對(duì)照組小鼠用T 檢驗(yàn)方法分析差異，顯著性差異用*p ＜ 0.05, p＜0.01 或者 #p＜0.05, ##p＜0.01 表示。 |
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