c57bl/6小鼠也被稱為c57 black 6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個完成基因組測序的小鼠品系。

利用CRISPR /Cas9 技術(shù)，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法進行鑒定及分析。

1基因型鑒定

   在基因水平鑒定，可以檢測到純合小鼠。

2 該基因在敲除組織部位的蛋白表達水平

  對人源化小鼠組織取材，在白細胞中，通過反轉(zhuǎn)錄PCR只檢測到人源CTLA4基因的表達。

3生長發(fā)育和生存率情況

  該基因人源化小鼠壽命正常，組織器官中未觀察等到淋巴細胞的浸潤，在出生后10個月內(nèi)沒有觀察到自身免疫性疾病發(fā)展的跡象，也未觀察到生長情況異常。

    4 CTLA4人源化小鼠中，CTLA4單克隆抗體伊匹木減緩腫瘤生長速度

目前批準用于臨床的抗CTLA4抗體可以與人源CTLA4結(jié)合，但不會與鼠源CTLA4交叉反應(yīng)^[11]。為了檢測建立的CTLA4^h/h小鼠是否可以用于臨床藥物篩選，我們比較了CTLA4單克隆抗體伊匹木（Ipilimumab）在CTLA4^h/h 和CTLA4^m/m小鼠中抑制腫瘤生長的能力。用黑色素瘤細胞系B16分別移植入CTLA4^h/h 和CTLA4^m/m小鼠，在移植后第3、5、7天，伊匹木單抗以100μg/只的劑量進行3次腹腔注射，觀察腫瘤生長至14天。在CTLA4^h/h小鼠中，伊匹木單抗減緩腫瘤生長速度（圖6a，b），在第14天時，CTLA4^h/h小鼠中腫瘤質(zhì)量低于CTLA4^m/m小鼠（圖6c，d）。結(jié)果顯示，伊匹木單抗可以在我們建立的CTLA4^h/h小鼠中發(fā)揮有效作用。

注：向CTLA4^h/h（左腋下）和CTLA4^m/m小鼠（右腋下）皮下注射5×10⁵ B16黑色素瘤細胞，并在第3、5、7天（如箭頭所示），腹腔注射依匹木單抗100μg/只，觀察并測量腫瘤直徑至細胞移植后14天（a，b）。在細胞移植后14天時取出腫瘤稱重（c，d）。數(shù)據(jù)表示平均值±標準誤，每組6–8只小鼠。使用單因素方差分析（Dunnett’s test）進行統(tǒng)計。*P < 0.05, P < 0.01。

圖5在CTLA4^h/h小鼠中，伊匹木減緩B16黑色素瘤生長速度