1、APC^min基因信息

APC（adenomatosis polyposis coli）基因編碼的蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，充當(dāng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑。APC-β-catenin-TCF主導(dǎo)的Wnt通路失調(diào)是家族腺瘤息肉病發(fā)生的主要途徑。APC蛋白表達(dá)的缺失或降低可能導(dǎo)致β-catenin免于降解，使游離的β-catenin在胞漿內(nèi)集聚并進(jìn)入核內(nèi)，激活相關(guān)靶癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞癌變的發(fā)生。APC蛋白還涉及其他生物調(diào)節(jié)過(guò)程，包括細(xì)胞遷移和粘附，轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞凋亡。APC-Min（Min: multiple intestinal neoplasia）突變小鼠特指APC基因第850位氨基酸出現(xiàn)突變的C57BL/6J小鼠。APC基因第850位氨基酸從Leu突變成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止。APC-Min小鼠品系采用基因編輯技術(shù)制作，該品系純合子不能存活。高脂飲食條件下，雄性和雌性雜合小鼠有明顯的腸道腺瘤且數(shù)量較多，多見(jiàn)于回腸和空腸。因此，APC-Min小鼠模型是理想的腸道腫瘤模型。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

APC^Min/+小鼠發(fā)病機(jī)制是突變的基因產(chǎn)物,截短APC蛋白導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞胞質(zhì)β-catenin蛋白的積累而后使其入核與TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)下游基因CyclinD 1等原癌基因的活化，但是其腺瘤發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和其他生物學(xué)特性尚未探索清楚。

3、研究背景

結(jié)直腸癌是世界上第三大惡性腫瘤[1]。從腫瘤學(xué)角度研究，結(jié)結(jié)腸癌的誘發(fā)與DNA的錯(cuò)配修復(fù)密切相關(guān)，并涉及到多個(gè)癌癥相關(guān)基因的復(fù)雜變化過(guò)程[2-4]。1991年研究人員發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腺瘤性息肉基因（adenomatous polyposis coil,APC）是誘發(fā)家族性腺瘤息肉?。╢amolial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP）的主要原因，且APC基因突變是誘發(fā)結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件[5]。FAP的主要特征是：結(jié)直腸中發(fā)育異常的病灶逐漸增長(zhǎng)，并發(fā)展成為數(shù)百或數(shù)千個(gè)腺瘤性息肉或腺癌。APC主要在細(xì)胞核、漿中發(fā)揮重要的作用，并在機(jī)體多個(gè)組織器官和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，如肝臟、腸和腸癌細(xì)胞系等[6-7]。結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因，多步驟參與的過(guò)程，與生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳因素和多基因突變都密切相關(guān)。由于在人體研究存在諸多限制，因此需要一種客觀性、重復(fù)性、公認(rèn)性均較好的動(dòng)物模型進(jìn)行深入研究。

[1] FERLAY J, SHIN H R, BRAY F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 [J]. International journal of cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

[2] DE LA  CHAPELLE  A. Genetic predisposition to colorectal cancer [J]. Nature reviews cancer, 2004, 4(10): 769-780.

[3] MECKLIN J P. Frequency of hereditary colorectal carcinoma [J]. Gastroenterology, 1987, 93(5): 1021-1025.

[4] PONZ  DE  LEON  M,  SASSATELLI  R,  SACCHETTI  C,  et  al.  Familial aggregation  of  tumors  in  the  three-year  experience  of  a  population-based

colorectal cancer registry [J]. Cancer research, 1989, 49(15): 4344-4348. 

[5] KINZLER  K  W,  NILBERT  M  C,  SU  L  K,  et  al.  Identification  of  FAP  locus genes from chromosome 5q21 [J]. Science, 1991, 253(5020): 661-665.

[6] Su  LK,  Kinzler  KW,  Vogelstein  B,  Preisinger  AC,  Moser AR,  Luongo  C, Gould  KA,  Dove  WF.  Multiple  intestinal neoplasia  caused  by  a  mutation  in  the murine  homolog  of  the APC gene. Science, 1992, 256(5057): 668−670.

[7] Silverman  KA,  Koratkar  R,  Siracusa  LD,  Buchberg  AM. Identification  of  the  modifier  of  Min  2  (Mom2)  locus,  a  new  mutation  that  influences Apc-induced  intestinal  neo-plasia. Genome Res, 2002, 12(1): 88−97.

APC^Min/+小鼠，C57BL/6J小鼠，體重秤，清潔級(jí)動(dòng)物房，手術(shù)剪，耳標(biāo)，IVC籠盒，Co60照射的高脂飼料，PBND，蛋白酶K, promega GO TAQ Green Master Mix, takara 100bp DNA ladder, TBE緩沖液，亞甲藍(lán)，小鼠抗人β-catenin單克隆抗體(BD Trans-ductionLaboratorie,Cat,610154),小鼠抗人cyclinD 1(SantaCruz,Cat,sc-8396);二抗為過(guò)氧化辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG, DAB顯色液，蘇木精染液，顯微鏡，凝膠成像儀，甘油三酯試劑盒及總膽固醇試劑盒等。

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程： APCMin/+雄性成年小鼠和C57雌性成年小鼠以1∶2的比例雜交，三個(gè)月后，其F1代中既有APCMin/+小鼠（腺瘤表型），又有C 57小鼠，進(jìn)行全同胞兄妹交配，擴(kuò)大種群。使用PCR方法對(duì)新生小鼠進(jìn)行剪尾提取基因簽定。小鼠在正常飼養(yǎng)時(shí)或者高脂飼料飼養(yǎng)時(shí)均會(huì)出現(xiàn)腸道腫瘤，但是腫瘤數(shù)量，體積隨著飼養(yǎng)年齡增長(zhǎng)而具有明顯差異。 

該模型使用HE方法對(duì)APC min小鼠的小腸大腸部位進(jìn)行病理評(píng)估，確認(rèn)小鼠在小腸和大腸部位可以形成腺瘤，比較不同周齡小鼠的腺瘤數(shù)目和大小，發(fā)現(xiàn)腺瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法確定β-catenin的表達(dá)量變化，進(jìn)而助于闡明其發(fā)病機(jī)制。通過(guò)檢測(cè)24周齡小鼠的紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白、總膽固醇及甘油三酯含量，發(fā)現(xiàn)隨著腺瘤數(shù)目和體積的增大對(duì)小鼠的影響。