斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

1. 實驗動物

野生型斑馬魚 AB 或 TU 品系 5 dpf 幼體。斑馬魚的位聽覺器官由相當于哺乳動物內(nèi)耳的耳囊及其附屬結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括神經(jīng)丘(有數(shù)個位于中心的毛細胞和圍繞在周圍的支持細胞構(gòu)成)、半規(guī)管和兩個耳囊（橢圓囊和圓囊，相當于人的卵圓窗和圓窗），其功能與人類內(nèi)耳相同。另外，在斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)上的神經(jīng)丘毛細胞也具有位覺功能。斑馬魚 5-dpf 幼體直到成年，其對聲音的刺激域和頻寬是不變的。因此，斑馬魚的位聽覺器官是研究位聽覺的理想模型。

2. 造模化合物及其對斑馬魚的處理

造模藥：氨基糖苷類藥物：慶大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)和鏈霉素(Streptomycin)。三種造模藥通過預(yù)實驗確定給藥濃度梯度。均使用人工海水直接配置。將發(fā)育至 6 hpf 的斑馬魚胚胎暴露于上述三種氨基糖苷類藥液中，直至 72 hpf。撤去藥液，用正常飼養(yǎng)液清洗斑馬魚后，繼續(xù)發(fā)育至 5、6 dpf，進行后續(xù)處理。

3. 模型分析指標

（1） 癥狀觀察

斑馬魚身體平衡失調(diào)和體位異常與其位覺功能損傷相關(guān)。正常斑馬魚的 5 dpf幼體靜止時體位為俯位。斑馬魚幼體在靜止時呈斜側(cè)位，或游動姿態(tài)異常，均為體位失衡。

（2） 毛細胞損傷檢測

取野生型和造模藥處理的斑馬魚幼體（6 dpf），分別浸入活體熒光染料 1 μM Yo-Pro-1（Invitrogen）的人工海水中避光孵化 1 小時，將斑馬魚用人工海水洗三 次，再將胚胎置于麻醉劑 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonate salt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉后在熒光顯微鏡下觀察毛細胞形態(tài)、數(shù)量和排列，并拍攝、計數(shù)。

（3） 病理診斷

顯微鏡下觀察活體幼體耳結(jié)構(gòu)的變化，包括半規(guī)管和耳囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。以同批野生型斑馬魚幼體為正常對照組，藥物處理組撤藥 2 天后，以耳石周圍的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個部位的神經(jīng)丘毛細胞作為主要觀察對象，結(jié)合側(cè)線神經(jīng)丘和毛細胞的觀察、計數(shù)。以神經(jīng)丘毛細胞數(shù)量減少和毛細胞結(jié)構(gòu)異常為病理診斷指標。

（4）基因檢測

RT-PCR 方法檢測聽覺發(fā)育基因的轉(zhuǎn)錄水平：

收集野生型和藥物不同濃度處理胚胎各 40 枚, 用 Trizol 提取總 RNA; 以 AMV 反轉(zhuǎn)酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 3 Co.) 合成 cDNA1st 模板；進行常規(guī) PCR。以 β-actin 基因作為內(nèi)參基因。PCR 產(chǎn)物電泳, 凝膠成像分析儀拍照記錄。