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酶活性檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-02-22 13:49:38 更新時(shí)間：2025-02-21 13:55:55

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酶活性檢測(cè)是生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和環(huán)境科學(xué)中的重要技術(shù)手段，用于定量分析酶的催化能力，評(píng)估生物體代謝狀態(tài)或環(huán)境樣品中的生化反應(yīng)動(dòng)態(tài)。以下從檢測(cè)原理、常用方法、實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)際應(yīng)用等方面進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

一、酶活性檢測(cè)的基本原理

酶活性是指單位時(shí)間內(nèi)酶催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的能力，通常以酶活力單位（U）表示，定義為在特定條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量。檢測(cè)需滿足以下核心條件：

最適反應(yīng)環(huán)境：包括溫度（如25℃或37℃）、pH（依酶種類而定）、底物濃度（需過(guò)量以測(cè)初速度）及離子強(qiáng)度。
反應(yīng)速率測(cè)定：通過(guò)監(jiān)測(cè)底物減少或產(chǎn)物生成的量，計(jì)算初始反應(yīng)速率。常用方法包括分光光度法、熒光法、同位素標(biāo)記法等。

二、常用酶活性檢測(cè)方法

1. 分光光度法

原理：利用底物或產(chǎn)物在特定波長(zhǎng)下的吸光度差異進(jìn)行定量。例如：
- 超氧化物歧化酶（SOD）：通過(guò)抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光還原反應(yīng)，測(cè)定560nm吸光度變化。
- 過(guò)氧化氫酶（CAT）：監(jiān)測(cè)H?O?在240nm處的吸光度下降速率。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適用于多數(shù)氧化還原酶。

2. 熒光法

原理：基于底物或產(chǎn)物的熒光特性差異。例如，鄰苯三酚自氧化反應(yīng)中，通過(guò)熒光強(qiáng)度變化測(cè)定SOD活性。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度比分光光度法高，適用于微量樣品檢測(cè)8。

3. 滴定法

原理：通過(guò)化學(xué)滴定法測(cè)定產(chǎn)物量。例如，CAT活性可通過(guò)高錳酸鉀滴定未分解的H?O?間接計(jì)算。
適用場(chǎng)景：無(wú)特定光吸收變化的酶反應(yīng)，需與其他方法偶聯(lián)使用。

三、實(shí)驗(yàn)操作步驟與要點(diǎn)

以植物抗氧化酶（SOD、CAT、POD）為例，具體流程如下：

1. 樣品制備

材料處理：取植物組織（如葉片）0.5g，預(yù)冷磷酸緩沖液（pH7.8）研磨，離心（10,000r/min，10min）后取上清液為粗酶提取液。
注意事項(xiàng)：添加聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）以去除酚類干擾。

2. 反應(yīng)體系配制

SOD測(cè)定：
- 混合130mmol/L甲硫氨酸、750μmol/L NBT、100μmol/L EDTA-Na?及酶液，光照反應(yīng)20min后測(cè)定560nm吸光度。
- 計(jì)算公式：SOD活性（U/g）=(A?−A?)×V?/(0.5×A?×FW×V?)，其中A?為對(duì)照管吸光度，A?為樣品管吸光度。
CAT測(cè)定：
- 在240nm下監(jiān)測(cè)H?O?分解速率，以每分鐘吸光度下降0.1為1個(gè)活性單位。
POD測(cè)定：
- 愈創(chuàng)木酚與H?O?反應(yīng)生成褐色產(chǎn)物，測(cè)定470nm吸光度變化，以每分鐘ΔA???增加0.01為1個(gè)活性單位。